Focalizzazione del flusso idrodinamico 3D semplificata per il laboratorio

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 14671 (2023) Citare questo articolo

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Il controllo accurato della posizione di un fluido e di una particella all'interno della piattaforma lab-on-a-chip è un prerequisito fondamentale per molti processi di analisi a valle, come rilevamento, intrappolamento e separazione, spostando il rilevamento a livello di singola particella. Con lo sviluppo della tecnologia di fabbricazione microfluidica, la focalizzazione delle particelle/cellule è passata da due a tre dimensioni. La messa a fuoco idrodinamica 3D, che ordina e allinea la nuvola di particelle in arrivo in modo che passino una per una attraverso l'area di interrogazione, consente nuove possibilità e scoperte nel sistema di analisi a cellula singola. Nonostante gli eccellenti risultati mostrati in letteratura, manca ancora un dispositivo in grado di soddisfare contemporaneamente i requisiti di elevata produttività, compattezza, elevata integrabilità e facilità d'uso per diventare un centro di lavoro ampiamente accettato per la ricerca biomedica e le applicazioni cliniche. Qui, abbiamo proposto un esclusivo dispositivo microfluidico focalizzato sul flusso 3D sepolto nel substrato di silice fusa che combina potenzialmente tutti questi vantaggi. Progettando un canale campione sospeso all'interno di un canale buffer più grande, realizzato sfruttando la tecnica della micromacchina assistita da laser, è stata dimostrata una capacità di focalizzazione non dipendente dalle dimensioni. Con elevata precisione è stato ottenuto un flusso centrale spazialmente e temporalmente stabile di una miscela di particelle PS da 15 μm e 6 μm verso una soluzione di microsfere PS da 1 μm. Infine, per testare la risoluzione di messa a fuoco ottenibile, il chip è stato testato per il rilevamento dei batteri Escherichia Coli in soluzione acquosa come prova del concetto di applicazione biologica.

La manipolazione precisa dei fluidi a bordo di piattaforme microfluidiche ha suscitato negli ultimi anni l'attenzione del campo di ricerca Lab-On-a-Chip (LOC), per l'ampio spettro di applicazioni che possono essere implementate. Oltre a ridurre drasticamente la quantità di campioni da processare e a ridurre le dimensioni degli strumenti su scala portatile, la capacità di controllare accuratamente la posizione di un fluido, e quindi anche delle particelle che vi fluiscono, all'interno dei dispositivi microfluidici ha spostato il rilevamento a il livello della singola particella. Ciò migliora notevolmente la sensibilità e la quantità di informazioni estraibili. Diversi campi hanno già beneficiato di questi vantaggi, come quello biomedico, ad esempio la citometria a flusso e il rilevamento di singole particelle1, o quello ambientale, ad esempio il monitoraggio dei cambiamenti climatici, la contaminazione microbica dell'acqua2, e l'industria, quella dei cosmetici3 e della purezza di alimenti e bevande. controllo2. Le particelle che fluiscono all'interno di una piattaforma microfluidica, soprattutto ad alte concentrazioni, si distribuiscono in modo casuale nella sezione trasversale del canale, influenzando drasticamente l'efficienza di qualsiasi ulteriore fase di analisi4. Pertanto, il principio fondamentale alla base della focalizzazione del flusso 3D è ordinare la nuvola di particelle in arrivo, allineandole in modo che attraversino l'area dell'interrogatorio una per una. Pertanto, in questa prospettiva, il dispositivo di focalizzazione ideale dovrebbe tenere conto della presenza di una o più fasi di analisi a valle (ad esempio rivelazione, intrappolamento e separazione), mentre per essere in grado di gestire particelle molto piccole e anche molecole, un processo non dipendente dalle dimensioni la capacità di messa a fuoco è un punto di svolta. Per questo motivo, i requisiti critici da soddisfare sono la compattezza, per non pregiudicare la portabilità della piattaforma, un throughput elevato, per non rallentare l’intero processo di analisi, e la facilità d’uso, per rendere il dispositivo quanto più automatizzato e flessibile possibile. . Molte strategie diverse hanno già tentato di affrontare questa sfida. Principalmente si possono identificare due approcci distinti: metodi che inducono forze sulle particelle esternamente (ovvero attive) o internamente (ovvero passive). Nel primo caso, i campi di forza più utilizzati sono acustici5, 6, magnetici7 ed elettrici8, 9. Sebbene siano metodi efficaci, la necessità di ulteriori stimoli esterni complica sia il processo di fabbricazione, richiedendo l'integrazione di elementi come trasduttori piezoelettrici, magneti , ed elettrodi, e il funzionamento, che richiede il controllo della generazione di forza oltre al flusso. Quindi, affinché il campo agisca sulla traiettoria delle particelle, è necessario limitare le portate, ottenendo portate da 0,85 µL/min a poche centinaia di μL/min e solo in casi limitati intorno a 500 µL/min4, 6. I metodi passivi, invece, esercitano un'azione di focalizzazione proprio grazie alla loro configurazione di flusso. In questo caso si può fare un’altra distinzione: alcuni approcci utilizzano effetti senza guaina, dovuti alle forze inerziali generate dalla geometria del canale10 o dall’integrazione di strutture, come scanalature o pilastri, nel canale11, 12, mentre altri utilizzano ingressi multipli , da 1 a 4, per confinare il flusso del campione13,14,15,16. La microfluidica inerziale è un metodo interessante poiché consente di raggiungere velocità elevate (fino a pochi mL/min)17 e non sono necessari flussi nella guaina, riducendo così la complessità operativa. Tuttavia, la messa a fuoco inerziale ha difficoltà a migliorare la risoluzione di messa a fuoco soprattutto in spazi ristretti. È noto, infatti, che questi dispositivi sfruttano la competizione tra due forze agenti sul flusso delle particelle, fortemente legate alla loro dimensione: le forze di sollevamento indotte dal taglio e le forze di sollevamento indotte dalla parete17. Pertanto, per ottenere la focalizzazione del flusso è necessario utilizzare un solo diametro di particella alla volta. Inoltre, la focalizzazione di particelle vicine alla scala (sub-)micrometrica incontra difficoltà, poiché la lunghezza minima del microcanale richiesta per una focalizzazione efficace aumenta drasticamente al diminuire della dimensione delle particelle, influenzando la compattezza del chip e complicando l'integrazione di ulteriori fasi di analisi. Nei canali rettilinei la geometria e la lunghezza di focalizzazione variano a seconda del diametro delle particelle10,18,19,20,21, mentre nel caso dei canali a spirale22,23 o delle schiere di contrazione-espansione24, utilizzando una miscela di diverse dimensioni, diversi equilibri i punti sono impostati in posizioni diverse nella sezione del canale. Ciò si traduce in flussi multipli focalizzati che non sono adatti per una singola regione di interrogazione. Quindi, si osservano effetti inerziali quando la frazione volumetrica delle particelle è inferiore all'1%, per evitare che le interazioni particella-particella interrompano la focalizzazione25. Ciò significa che il campione deve essere diluito, diminuendo la produttività effettiva e richiedendo un'ulteriore fase di pre-elaborazione. Il modo concettualmente più semplice per confinare il flusso del campione al centro di un canale microfluidico, indipendentemente dalla dimensione delle particelle, è iniettare altri quattro flussi all'interno dello stesso canale. Molti lavori hanno implementato tale strategia, ottenendo buoni risultati di focalizzazione14, 16, 26, 27, ma ancora la necessità di gestire cinque (o sei) ingressi contemporaneamente non facilita l'utilizzo del dispositivo in applicazioni cliniche. Per questo motivo diversi gruppi hanno presentato soluzioni interessanti per ridurre il numero di porte di iniezione. Una delle strategie più utilizzate è quella di dividere un ramo originale prima di collegarlo al canale principale, diminuendo il numero di ingressi a due13, 28, 29. Oltre alla ridotta complessità di funzionamento di tali dispositivi, il flusso deve essere precisamente ripartito in tutti i rami per raggiungere un accurato posizionamento delle particelle. Pertanto, aumenta il rischio di introdurre asimmetrie nella manipolazione del fluido o nella geometria, durante i processi di fabbricazione o nel funzionamento sperimentale, ad esempio a causa di una bolla d'aria. Tripathi et al.30 hanno ottenuto una geometria semplificata con solo due ingressi e nessuna suddivisione, che sfrutta la combinazione di un flusso buffer e l'effetto vortice Dean dovuto ai canali curvi. Oltre alla buona efficienza di focalizzazione, la produttività è limitata a 100 µL/min. Invece, alcuni altri lavori hanno raggiunto un compromesso utilizzando due ingressi della guaina e riducendo le proporzioni del canale campione, in modo che il flusso buffer avvolga il flusso principale alla giunzione31, 32. Tuttavia, anche questi dispositivi mostrano un throughput limitato che varia da µL/min a 30 µL/min, principalmente a causa della deformabilità del polidimetilsilossano (PDMS), di cui sono costituiti. Invece, Patel et al.33 hanno utilizzato una strategia simile, ma la portata del loro dispositivo non è limitata grazie alla microfresatura del polimetilmetacrilato (PMMA). Tuttavia, poiché le loro particelle focalizzate scorrono sul fondo del canale principale, il dispositivo è esposto a rischi di intasamento. Altre soluzioni creative sono rappresentate dai tentativi di circondare un canale principale tamponando gli ingressi, integrando due micropipette34, diversi microcapillari35 o un microugello36. Oltre all'elegante realizzazione, i dispositivi sono molto fragili e le prestazioni sono strettamente legate all'accuratezza del processo di fabbricazione.